TÓM TẮT
Để so sánh sự lan tơ của Phellinus linteus, 3 kỹ thuật cấy được thử nghiệm: sterilized short log inoculation, drilling inoculation và log-end sandwich inoculation. Kết quả nghiên cứu cho thấy quá trình lan tơ diễn ra trên gỗ khúc tốt nhất bởi kỹ thuật sterizilied short log inoculation. Sự sinh trưởng và phát triển hoàn thiện của hệ sợi nấm P. linteus tối ưu trong điều kiện: chiều dài khối gỗ được sử dụng: 20 cm, ẩm độ 42 %. Tuy nhiên, sự sinh trưởng của hệ sợi trên khúc gỗ sẽ được nhanh hơn nếu khử trùng trong 12 tiếng. Sau khi hoàn thiện quá trình lan tơ khoảng 5 – 6 tháng, khúc gỗ được chôn xuống đất giúp cho việc kích thích hình thành quả thể của P. linteus. Sự hình thành quả thể của nấm P. lineus sẽ rất tốt khi nuôi trồng ở điều kiện trong nhà, nhiệt độ khoảng 31-35 oC, độ ẩm không khí trên 96%.
GIỚI THIỆU
Ngày nay, nấm đang dần trở thành nguồn thực phẩm chức năng và nguồn dược liệu thay thế. Bên cạnh những công dụng trong y học của những loài thuộc chi Ganoderma, một số loài nấm thuộc chi Phellinus cũng đang dần trở nên phổ biến ở Hàn Quốc. Đặc biệt, Phellinus linteus cũng đã được công bố rằng chúng có tính kháng ung thư và tăng cường hệ miễn dịch, đáng chú ý hơn cả là khả năng đối kháng với các tế bào ung thư được cắt ra từ động vật như Sarcoma 180 (Ikekawa et al., 1968). Loài nấm này được biết đến nổi tiếng với tên gọi nấm “Thượng Hoàng” hàng trăm năm nay trong y học cổ truyền Trung Hoa (Chen và Chen, 2000). P. liteus lần đầu tiên được mô tả như là Polyporus linteus bởi Berkeley và Curtis (1860), sau đó được điều chỉnh thành Phellinus linteus bởi Teng (1964). Từ hệ sợi của những loài nấm đó, nhiều nhà nghiên cứu khoa học đã phân lập thành công một số hợp chất quan trọng giúp tăng cường hệ miễn dịch ở người (Chung và Kim, 1994; Lee et al., 1996; Song et al., 1998).
Về đặc điểm lý tính, thành phần hóa học, và quá trình phát triển những phương pháp nuôi trồng nấm P. linteus và những loài khác thuộc chi Phellinus cũng đang được đặc biệt chú trọng nghiên cứu (Chi et al., 1996; Jung et al., 1997). Quả thể nấm P. linteus được đánh giá cao về hoạt tính kháng ung thư bởi hoạt tính sinh học của một số phức hợp protein-polusacharide hiếm có trong tự nhiên (Oh và Han, 1993). Loài nấm này thường được phát hiện trên cây dâu tằm (Morus sp.) và một số loài cây lâu năm khác ở Hàn Quốc (Kim et al., 1999). Mặc dù có nhiều giá trị vượt trội về mặt y học, việc nghiên cứu nuôi trồng nhân tạo nấm Thượng Hoàng vẫn còn khan hiếm.
Nghiên cứu này nhằm cố gắng tìm ra những phương pháp có thể nuôi trồng nhân tạo nấm Thượng Hoàng bằng kỹ thuật nuôi trồng trên những khúc cây gỗ.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Quy trình nuôi trồng quả thể nấm Thượng Hoàng được chia làm 2 giai đoạn chính. Giai đoạn thứ nhất bao gồm cả công tác chuẩn bị nguyên liệu (stock) nuôi trồng, phôi; giai đoạn thứ hai bao gồm việc chuẩn bị cơ chất cho sự phát triển và hình thành nấm.
1. Nhân giống
Giống Phellinus linteus (ASI 26099) được lấy từ Viện Khoa học và Công nghệ Nông nghiệp Quốc Gia, RDA và được hoạt hóa trên môi trường thạch nghiêng YMA (Yeast Malt Agar). Thành phần môi trường bao gồm: 0,5% peptone, 0,3% yeast extract, 0,3% malt extract, 1% dextrose và 2% agar, định mức 1000 mL nước cất. Cấy chuyền định kỳ 30 ngày 1 lần. Giống gốc ASI 26099 được phân lập từ quả thể thu thập được từ tỉnh Kwangwon và được định danh với tên khoa học Phellinus linteus (Park et al., 2001), còn được gọi là nấm Thượng Hoàng Coera.
2. Điều kiện nuôi ủ
Môi trường YMA được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121oC (15 psi) trong 20 phút và đổ vào đĩa petri. Môi trường sau khi để nguội, được cấy chuyền giống nấm từ trong ống thạch nghiêng, mang đi ủ để dùng cho các bước tiếp theo.
3. Nhân giống cấp 2
Mùn cưa của cây được trộn với cám gạo tỉ lệ 4:1, thêm nước để độ ẩm đạt 65%. Cho hỗn hợp vào chai thủy tinh 250 mL, hấp khử trùng ở 121oC trong 45 phút. Sau khi hấp, môi trường được để nguội khoảng 20oC. Tiến hành cấy giống bằng cách cắt từng mảng sợi nấm trên agar cho vào chai thủy tinh, chuẩn bị nguồn giống cho nhân giống cấp 3.
4. Nhân giống cấp 3
Các bước chuẩn bị môi trường cho nhân giống cấp 3 cũng giống như quy trình chuẩn bị môi trường nhân giống cấp 2. Hỗn hợp mùn cưa và cám gạo được cho vào từng chai nhựa chịu nhiệt PE 850 mL, hấp khử trùng ở 121oC trong 90 phút, để nguội đến 20oC. Cấy chuyền giống từ chai giống cấp 2, khoảng 2 – 3 muỗng đầy giống cho mỗi chai PE 850 mL. Sau đó mang ủ ở 25 oC trong 45 ngày, cho đến khi tơ lan đều kín hết đáy chai, thì giống đã có thể sẵn sàng cho bước nuôi cấy trên cây gỗ.
5. Quy trình nuôi cấy trên gỗ
Quy trình nuôi trồng nấm Phellinus linteus được môi tả như sau. Chọn và đốn hạ gỗ cây, cắt gỗ thành từng đoạn nhỏ, cho vào bao nilon chịu nhiệt PE, hấp khử trùng, cấy giống, để tơ lan hoàn toàn, chôn những khúc gỗ có tơ lan hoàn thiện xuống đất, chăm sóc tạo quả thể từ khi còn là chồi non đến gian đoạn quả thể trưởng thành.
6. Tiêu chí lựa chọn gỗ
Để có thể lựa chọn những khúc gỗ tự nhiên phù hợp cho việc nuôi trồng nấm Thượng Hoàng, tỉ lệ C/N của mùn cưa được xác định bởi máy phân tích CHN-1000 (Leco corp., St. Joseph, Mich.). Môi trường được chuẩn bị từ những loại mùn cưa của gỗ cây khác nhau: Morus albab (dâu tằm), Quercus acutissima (yến mạch), Poplus euamericana (cây Dương) và Castanea crenata (cây Dẻ). Độ ẩm của mỗi loại mùn cưa được điều chỉnh bằng cách thêm nước cho đến khi ẩm độ đạt 65%. Cho 50 gr mỗi loại mùn cưa vào ống (kích thước Ø 3 x 20 cm), hấp khử trùng ở 121 oC trong 60 phút. Sau khi để nguội khoảng 20 oC, cấy 1 muỗng giống cấp 3 vào ống môi trường hỗn hợp mùn cưa. Các ống môi trường sau khi cấy được ủ ở phòng tối và theo dõi sự phát triển của tơ nấm. Sau 40 ngày ủ, tỉ lệ C/N của mùn cưa sẽ được xác định lại.
7. Phương pháp cấy giống
Những khối gỗ trong tự nhiên được lựa chọn sẽ được cắt ra thành những khúc có chiều dài khoảng 60 cm, đặt vào túi nilong PE chịu nhiệt, đóng nút bông. Những túi nilong chứa khối gỗ này được hấp khử trùng ở 121oC (15 psi) trong 2 giờ, sau đó để nguội đến 20 oC. Meo cấp 3 được cấy lên bề mặt của khúc gỗ, viên meo lan kín tơ dày 0,5 cm (20 – 30 gr), sau đó được đậy kín bằng nút bông. Những khối gỗ đã cấy được ủ trong phòng tối, được kiểm soát tốc độ tăng trưởng. Sau 1 tháng ủ tối, sự phát triển tơ nấm trên khúc gỗ sẽ được quan sát.
8. Kích thước của khối gỗ
Gỗ được cắt thành những đoạn có chiều dài khác nhau: 20 cm, 30 cm, 40 cm, 50 cm và 60 cm và đặt vào túi PE. Sau khi cấy giống 2 tháng, sự phát triển của tơ nấm được quan sát. Các phương pháp khử trùng và cấy giống được thực hiện tương tự như trên.
9. Thành phần của khối gỗ
Những khối gỗ lần lượt có ẩm độ 35%, 40% và 42%. Khối gỗ có độ ẩm 35% được chuẩn bị bằng cách sấy khô trong 3 – 4 tháng sau khi được đốn chặt, dùng làm đối chứng. Khối gỗ có độ ẩm 40% được chuẩn bị bằng cách ngâm khối gỗ đã sấy dưới nước trong 1 ngày. Khối gỗ có độ ẩm 42% được điều chỉnh bằng cách thêm nước vào khối gỗ được ngâm 1 ngày. Phương pháp cấy giống và ủ thực hiện tương tự cho những khối gỗ sau khi đã hấp khử trùng. Sau 4 tháng ủ lan tơ, sự sinh trưởng và phát triển của tơ nấm sẽ được quan sát và ghi nhận.
10. Thời gian hấp khử trùng cơ chất (khối gỗ)
Những khối gỗ có kích thước 20 cm, đường kính 15 cm được cho vào túi nilong, buộc chặt và đậy bằng nút bông, hấp khử trùng ở 121oC (15 psi) trong thời gian lần lượt là 8 giờ, 10 giờ, 12 giờ, và 14 giờ. Cấy lên mặt trên của khối gỗ bằng meo viên có tơ lan tín dày 0,5 cm hoặc hơn. Sau 6 tháng nuôi ủ, sự sinh trưởng và phát triển của hệ sợi nấm sẽ được quan sát và ghi nhận.
11. Thành phần phụ gia
Khối gỗ được đặt vào túi PE với những thành phần phụ gia khác nhau, riêng rẽ như: mùn cưa yến mạch, mùn cưa : cám gạo = 4 : 1, lá cây yến mạch, lá cây yến mạch : cám gạo = 4 : 1, được thêm vào trên mặt khúc gỗ trước khi đóng nút. Tất cả được hấp khử trùng ở 121oC (15 psi) trong 14 giờ, để nguội và cấy giống tương tư như những thí nghiệm trên. Sau 3 tháng ủ lan tơ, sự sinh trưởng và phát triển của khối gỗ được quan sát và ghi nhận.
12. Thời gian ủ lan tơ
Những khối gỗ đã cấy giống được nuôi ủ trong phòng tối ở các điều kiện nhiệt độ được kiểm soát khoảng 22 – 25oC, độ ẩm không khí 65 – 70%. Thời gian ủ khác nhau: 3 tháng, 4 tháng, 5 tháng và 6 tháng. Sau khi lan tơ hoàn toàn, những khối gỗ sẽ được chôn xuống đất trong nhà kín trồng nấm. Sự hình thành quả thể được ghi nhận và đánh giá theo từng thời gian tơ khác nhau.
13. Nhiệt độ của nhà kín nuôi trồng nấm
Những khối gỗ đã lan tơ tốt được tách khỏi bao PE và chôn thẳng đứng xuống đất. Nhiệt độ nhà nuôi trồng được kiểm soát lần lượt ở 3 khoảng: 20 – 25 oC, 26 – 30 oC, 31 – 35 oC. Sự hình thành ban đầu của mầm quả thể nấm được khảo sát theo từng nhiệt độ mà nhà nuôi trồng nấm đã được điều chỉnh.
14. Độ ẩm không khí trong nhà kín nuôi trồng nấm
Những khối gỗ đã lan tơ tốt được chôn thẳng đứng xuống đất, trong nhà kín với nhiệt độ được kiểm soát 31 – 35oC. Độ ẩm được kiểm soát lần lượt trong các khoảng 80 – 90%, 91 – 95%, và 96 – 99%. Sự hình thành quả thể được quan sát và đánh giá theo từng khoảng độ ẩm được khảo sát.
15. Độ sâu khi chôn khối gỗ
Những khối gỗ đã lan tơ tốt được chôn thẳng đứng xuống đất ở những độ sâu khác nhau: ¼ chiều dài, ½ chiều dài và ¾ chiều dài khối gỗ. Chôn trong nhà kín nuôi trồng nấm ở điều kiện nhiệt độ được kiểm soát 31 – 35 %, độ ẩm 96 – 99%. Sự nẩy mầm và hình thành quả thể được ghi nhận và theo dõi theo từng độ sâu được chôn.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Tiêu chí chọn gỗ
Tỉ lệ C/N của mùn cưa trước khi được cấy giống của loại gỗ cây Dương (Poplus euamericana) là cao nhất, theo sau đó là cây Dẻ, dâu tằm và yến mạch (Bảng 1). Kết quả tỉ lệ C/N giảm sau 40 ngày nuôi cấy được mô tả ở bảng 1. Từ Bảng 1 cho thấy tỉ lệ C/N ở môi trường mùn cưa dâu tằm và yến mạch có sự sụt giảm nhẹ, trong khi mùn cưa gỗ hạt dẻ và gỗ dương lại giảm rất nhiều. Cây dâu tằm và yến mạch được lựa chọn cho việc nuôi trồng nấm P. linteus vì nấm Thượng Hoàng là một loài nấm lâu năm, và làm giảm ít tỉ lệ C/N của những loại cây này.
1. Phương pháp cấy
Đối với kỹ thuật cấy “sterilized short logs”, tơ chạy tốt nhất trên hai loại cây yến mạch và cây dâu tằm. Trong khi, phương pháp “drilling inoculation” và phương pháp “log-end sandwich inoculation” thì không thích hợp để nuôi trồng nấm Thượng Hoàng vì tỉ lệ lan tơ rất thấp, thấp dưới 7% (Bảng 2). Có nhiều mô hình nuôi cấy đã được sử dụng để cấy trong việc nuôi trồng nấm ở Hàn Quốc. Hai phương pháp cấy “drilling inoculation” và “log-end sandwich inoculation” là hai kỹ thuật cấy giống truyền thống ở Hàn Quốc lần lượt cho 2 loài nấm Lentinus edodes và Ganoderma spp., còn kỹ thuật “sterilized short logs” là kỹ thuật biến đổi cho công nghệ nuôi trồng những loài nấm này.
2. Kích thước gỗ
Để xác định kích thước gỗ phù hợp nhất cho việc lan tơ của hệ sợi, P. linteus đã được cấy lên các size gỗ khác nhau. Tốc độ lan tơ cần thiết của nấm Thượng Hoàng sau 2 tháng là 30 – 40 %, tuy nhiên chỉ lan được 5 -17 %. Kết quả khảo sát cho thấy kích thước khối gỗ càng ngắn thì tỉ lệ lan tơ càng có xu hướng tăng. Vì vậy, kích thước phù hợp nhất được lựa chọn là 20 cm, tuy nhiên, tỉ lệ lan tơ của hệ sợi trên khối gỗ 20 cm vẫn không nhiều hơn 17% (Bảng 3).
3. Thành phần khối gỗ
Sau 4 tháng ủ lan tơ, sự phát triển của hệ sợi được quan sát.
Tỉ lệ lan tơ hoàn toàn của hệ sợi nấm P. linteus trên khối gỗ có độ ẩm 35% và 40% lần lượt là 20% và 25%. Trong trường hợp khối gỗ có độ ẩm 42%, tỉ lệ lan tơ của hệ sợi là tốt nhất (Bảng 4). Theo kết quả nghiên cứu, ẩm độ cao thì tỉ lệ lan tơ và độ dày của tơ nấm sẽ mạnh hơn. Tỉ lệ lan tơ của hệ sợi hoàn toàn là dưới 27%. Rew và cộng sự (2000) đã báo cáo rằng tỉ lệ lan tơ hoàn toàn được của một phương pháp cấy tối ưu là 26%, đối với nấm P. pini.
4. Thời gian khử trùng cơ chất
Tỉ lệ lan tơ ban đầu và hoàn thiện của hệ sợi lần được ghi nhận là tốt nhất khi cơ chất được khử trùng ở 14 giờ, có tỉ lệ lần lượt là 98% và 85% (Bảng 5). Môi trường lỏng thông thường được hấp khử trùng theo chuẩn 121oC trong 15 phút, môi trường mùn cưa được khử trùng ở điều kiện 121oC, 90 phút. Mặt khác, túi nilong PE chứa các khối gỗ dùng để nuôi cấy P. linteus cần được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121oC/ 12 giờ. Tuy nhiên, tùy thuộc vào tính chất tự nhiên và khối lượng cơ chất, hoạt lực của tơ giống nấm mà các thông số khử trùng sẽ được tùy chỉnh cài đặt cho thích hợp.
5. Thành phần phụ gia
Việc bổ sung thêm phụ gia vào các khối gỗ giúp tỉ lệ lan tơ hoàn toàn được cao hơn so với các khối gỗ được sử dụng làm đối chứng (không bổ sung thêm bất cứ phụ gia nào) (Bảng 6). Trong các loại thành phần phụ gia được sử dụng, tỉ lệ lan tơ hoàn toàn và độ dày của hệ sợi nấm P. linteus đạt tốt nhất trên cơ chất khối gỗ được bổ sung thêm lá cây yến mạch : cám gạo = 4 : 1.
6. Thời gian ủ của khối gỗ
Để tìm ra thời gian ủ thích hợp cho khối gỗ, nhằm tạo điều kiện tốt nhất cho việc hình thành quả thể, những khối gỗ sau khi được cấy giống nấm đã được nuôi ủ ở những khoảng thời gian khác nhau như: 3 tháng, 4 tháng, 5 tháng và 6 tháng.
Những khối gỗ, đã ủ lan tơ trong khoảng thời gian 4 tháng, được chôn xuống đất thì bị nhiễm những loài nấm không mong muốn khác trong đất. Cho nên, mầm quả thể không thể hình thành ở nghiệm thức có thời gian ủ tơ 4 tháng này. Từ kết quả khảo sát cho thấy, thời gian tối thiểu để ủ tơ khối gỗ để có thể hình thành mầm và tạo quả thể là 5 tháng (Bảng 7).
7. Ảnh hưởng của nhiệt độ trong nhà kín nuôi trồng quả thể
Giai đoạn kích mầm tạo quả thể ở những khối gỗ nuôi trồng trong nhà kín được cài đặt nhiệt độ khoảng 31 – 35oC diễn ra tốt hơn so với những khối gỗ được nuôi trồng ở khoảng nhiệt độ 21 – 25oC (Bảng . Từ kết quả nghiên cứu trên cho thấy nhiệt độ trong nhà kín nuôi trồng quả thể phải luôn được kiểm soát trên 26oC.
8. Độ ẩm không khí trong nhà kín nuôi trồng quả thể
Các khối gỗ đã lan tơ hoàn thiện cho kết quả hình thành quả thể rất tốt ở nhà kín có độ ẩm không khí 96 – 99%. Trong khi, quả thể không hình thành ở những khối gỗ được nuôi trồng trong nhà kín có độ ẩm 81 – 90% (Bảng . Kết quả cho thấy độ ẩm cần thiết để quả thể hình thành thuận lợi là trên 91%.
9. Độ sâu khi chôn khối gỗ
Những khối gỗ đã lan tơ tốt được chôn thẳng đứng xuống đất với độ sâu chiếm ¼ hoặc ½ chiều cao khối gỗ cho kết quả hình thành mầm tốt hơn hết (Bảng . Trong trường hợp chôn khối gỗ hết ¾ chiều cao, quả thể chỉ có thể hình thành ở một phần nhỏ của khối gỗ. Việc chôn khối gỗ sâu như thế nào có mối liên quan mật thiết với ẩm độ trong nhà kín nuôi trồng quả thể. Nếu độ ẩm không khí trong nhà nuôi trồng quả thể không phù hợp hoặc không đủ, mầm quả thể nấm sẽ hình thành gần mặt đất, trong khi nếu độ ẩm không khí thích hợp, mầm quả thể nấm sẽ hình thành trên mặt của khối gỗ.
Quả thể của nấm Phellinus linteus ASI 26099 hình thành sau 1 năm nuôi cấy. Sự sinh trưởng của tai nấm kéo dài trong 2 năm trên khối gỗ, cứng, kích thước 124 x 85 mm. Bề mặt trên của tai nấm đồng tâm, rãnh cạn và có màu tối của hạt dẻ (Hình 1).
Nguồn: Hong, I. P., Jung, I. Y., Nam, S. H., Park, J. S., Cho, J. H., Lee, M. W., & Guo, S. X. (2002). Cultural characteristics of a medicinal mushroom, Phellinus linteus. Mycobiology, 30(4), 208-212.